Análisis bioinformático, detección y mutación de la proteína de unión a penicilina PbpA en Rhodococcus sp. Raquel Álvarez.
Trabajo bien elaborado, referencias escasas pero bien utilizadas, análisis de Artemis casi correcto, pero ha usado una secuencia de otro microorganismo para hacer el trabajo.
RESUMEN
Las bacterias pertenecientes al género Rhodococcus son Gram positivas con alto contenido en G+C y aerobios. En este trabajo se han analizado 17000 pares de bases pertenecientes al genoma de Rhodococcus sp., eligiendo una proteína perteneciente a la familia de las trasnpeptidasas, la Penicillin-binding protein PbpA, para su análisis. Se realizó un análisis bioinformático para conocer sus características morfológicas y fisicoquímicas, así como también se llevo a cabo una inactivación del gen y una mutagénesis para comprobar como la actividad de la proteína influía en el fenotipo de Rhodococcus sp. Posteriormente se realizó una purificación y una fusión con la proteína fluorescente verde para su localización en la membrana plasmática de la célula.
INTRODUCCIÓN
Las bacterias pertenecientes al género Rhodococcus son Gram positivas con alto contenido en G+C y aerobios. Presentan una amplia diversidad metabólica, sobre todo a los compuestos hidrófobos, como los hidrocarburos clorados, compuestos fenólicos, esteroides, lignina, carbón y petróleo (Finnerty, 1992). Es un grupo muy diverso de bacterias que posee la capacidad de degradar una gran cantidad de compuestos orgánicos. Los usos de Rhodococcus incluyen la producción esteroides bioactivos, la biodesulfurización del combustible fósil, y la producción de la acrilamida y del ácido de acrílico. (Larkin, Kulakov, & Allen, 2005). Algunos miembros del género Rhodococcus son conocidos agentes patógenos para los seres humanos, animales y plantas, aunque la mayor parte de las especies que pertenecen a este género no son patógenas.
Penicillin-binding protein PbpA
El trabajo está centrado en una proteína concreta, la Penicillin-binding protein PbpA (o proteína de unión a la penicilina A). Fig.1
Fig.1 Penicillin-binding protein 2x (pbp-2x). Single crystal X-ray diffraction, resolution 2.40Å
Existen numerosas PBPs diferentes y son habitualmente específicas de cada especie. Son proteínas situadas en la membrana plasmática de la bacteria e intervienen en la formación de la pared celular. La PbpA pertenece al grupo de PBP’s de alto peso molecular, tiene actividad transpeptidasa y actúan en la última fase de la formación del peptidoglycano (Murray, Popham, & Setlow, 1997). Forma un enlace peptídico entre dos D-ala de dos polímeros distintos de peptidoglycano formados en fases anteriores. Las PBP’s intervienen en la formación de la pared y por lo tanto en el crecimiento de la bacteria y en la conformación de la estructura (Wada & Watanabe, 1998).
El nombre de proteína de unión a penicilina (PBP) es debido a que estas enzimas son el sitio de acción de las penicilinas (y otros antibióticos ß-lactámicos) y las bloquean debido a que el anillo β-lactámico tiene una estructura espacial similar a la del residuo acil-D-alanin-D-alanina de las cadenas del peptidoglicano, que es el sustrato natural de las PBP (Zapun, Contreras-Martel, & Vernet, 2008).
Análisis Bioinformático de PbpA
Penicillin-binding protein PbpA se encuentra entre los nucleótidos 3810204 al 3811691 de la cadena complementaria del genoma de Rhodococcus sp., tiene una longitud total de 1.49kb que codifican para un péptido de 495 aminoácidos (ver Anexo 1).
Las características fisico-químicas de la proteína fueron analizadas bioinformáticamente mediante ProtParam. (ver Anexo 2)
Como anteriormente se ha comentado la PBPA está localizada en la membrana plasmática, no obstante se realizo el análisis bioinformático correspondiente prediciendo la situación de la proteína en la célula (PSORTb) y localizando hélices transmembrana en la proteína (TMHMM). También se buscó la presencia de péptido líder mediante SignalP 3.0 Server .
Los resultados indican que se trata de una proteína localizada en la membrana plasmática, con un dominio transmembrana y el resto de la proteína es extracelular. Por último se verificó la presencia de péptido señal. (ver Anexo 3). Penicillin binding protein PBPA presenta un dominio que pertenece a la superfamilia de trasnpeptidasas. Cataliza la reacción que da lugar al enlace peptídico entre dos D-ala (transpeptidación) en la formación del peptidoglycano de la pared celular (Macheboeuf et al., 2005)
Se realizó un análisis bioinformático para saber que familia pertenece la proteína mediante el programa Pfam reafirmando que se trata de un transpeptidasa.
Según los datos obtenidos se trata de un dominio transpeptidasa que comienza en el aminoácido 164 y termina en el 489.
Mediante la base de datos de proteínas del NBCI se busco la secuencia de aminoácidos de distintas especies de bacterias de la proteína PBPA con el fin de hacer un alineamiento y ver las zonas conservadas. Posteriormente se dibujó un árbol filogenético.
El sitio activo de la trasnspeptidasa es una serina que está conservada en todos los miembros de esta familia (Joris et al., 1988). (ver Anexo 4)
MATERIALES Y MÉTODOS
· Cepas bacterianas y condiciones de cultivo.
En el presente trabajo se utilizaron las siguientes cepas: Rhodococcus sp. E.coli K12 E.coli BL21(DE3).
Las cepas de E.coli son cultivadas en medio Luria-Bertani (LB) (1% triptófano, 0,5% de extracto de levadura y 0,5% de NaCl) a 37ºC.
Para la sobreexpresión de genes clonados los cultivos se crecieron en medio rico en triptófano (3,2%), 2% de extracto de levaduray 1% de NaCl. Rhodococcus sp. es cultivada en medio Brain Heart Infusion (BHI) a 30ºC.
Cuando sea necesario, se añadiran los siguientes suplementos en el medio:
Ampicilina, kanamicina, e IPTG.
· Amplificación del gen de interés por PCR.
Mediante PCR se amplificó un fragmento de 1172 pb del gen que codifica para la proteína PBPA. Los primers utilizados fueron diseñados por el programa informático Primer3. Está Ud. segura que estos primers amplifican el gen??? Para qué realiza esta amplificación???
Primer Directo: 5’- GCCACCTACGTTCAGGTCAT - 3’
Primer Reverso: 5’- TTGTTCTCGGAACCGATCAT - 3’
La reacción de PCR se llevó a cabo en un termociclador programado para realizar una desnaturalización inicial del ADN a 95ºC durante 4 min, seguida de 35 ciclos que comprenden las siguientes etapas: 40 segundos a 93ºC, 40 segundos a 55ºC y 55 segundos a 72ºC. La última extensión se prolongó durante 5 min.
El producto de amplificación se visualizó en gel de agarosa al 1,5% teñido con bromuro de Etidio
· Comprobación si el gen es esencial o no para el microorganismo.
Se realiza una interrupción génica mediante plásmidos suicidas. Para ello es necesario amplificar un fragmento interno del gen y clonarlo en un plásmido que no replicativo en Rhodococcus.
La obtención de plasmidos se realizo de igual forma que en el apartado anterior, mediante el programa Primer3.
Primer Directo: 5’- AACTACAACGGCTCCACCTG – 3’
Primer Reverso: 5’- TTGTTCTCGGAACCGATCAT – 3’
Para poder clonar el fragmento en un plásmido se les añade un sitio de corte en el extremo 5’. En el primer 1 un sitio HindIII y en el primer 2 un sitioBamHI, además de 3 nucleótidos para que el corte sea efectivo.
Primer Directo: 5’- CCCA/AGCTTAACTACAACGGCTCCACCTG – 3’
Primer Reverso: 5’- CGCG/GATCCTTGTTCTCGGAACCGATCAT – 3’
Con estos primers se amplifica un fragmento interno de 449 pb que va a ser clonado en un plásmido pUC19 (Fig.2) contiene el origen de replicación de E. coli, no replicando en Rhodococcus, y el gen de resistencia a ampicilina. También incluye el gen lacZ, donde se encuentra el sitio de clonación múltiple o polilinker.
Fig2. Plásmido pUC19
El plásmido es insertado en Rhodococcus mediante electroporación (Sekizaki et al., 1998). Si lleva el inserto del gen se integrará por recombinación simple en el genoma de Rhodococcus, inactivando el gen y produciendo un RNAm no funcional.
· Purificación de la proteína.
La purificación de la proteína se realiza mediante la amplificación del gen que codifica para PBPA con colas de histidina.
Los primers utilizados para la amplificación del gen son:
Primer 1: 5’- GGAATTCCA/TATGAACACACCGCTGCGCCG – 3’ (NdeI)
Primer 2: 5’- CCCA/AGCTTGCCCCCTTGTAGTCCGGCTG – 3’ (HindIII)
Los productos amplificados se clonan en el plásmido pET-28a(+) (Fig.3). (Novagen)
pET-28a (+) tiene 5369 pb y contiene el gen resistencia a kanamicina, posee una secuencia aminoterminal que contiene His·Tag/trombina/T7 Tag y una configuración adicional en el C-terminal el cual lleva una cola de histidinas para su purificación. Los genes clonados en el plásmido pET se transcriben bajo el control del promotor del fago T7, cuando se activa la T7 RNA polimerasa en la célula huésped. La expresión se induce con IPTG, el cual remueve al represor del operador para que se lleve a cabo la transcripción y se promueva la expresión de la proteína de interés (Tabor & Richardson, 1985).
Fig3. Plásmido pET-28a
El plásmido con el gen de interés se introduce mediante transformación en E.coli BL21(DE3) cuyo genoma contiene el gen que codifica para la T7 RNA polimerasa y carece de proteasas. Se seleccionan las cepas trasnformadas añadiendo al medio kanamicina.
La proteína fusionada a colas de histidina se purifica mediante cromatografía de afinidad utilizando resinas que llevan níquel unido a bolas de agarosa. Posteriormente para eliminar las colas de histidina utilizamos la peptidasa trombina, que corta en una serie de aminoácidos que se encuentran entre las histidinas y nuestra proteína.
Previamente se comprobó mediante PeptideCutter que la proteína a purificar no es degradada por la trombina.
· Comprobación de sitios de corte por enzimas de restricción.
Se comprobó mediante el programa NEBCutter que ninguno de los sitios de corte utilizados para la clonación en plásmidos estuviera presentes en la secuencia del gen. (Fig. 4)
Fig.4 Sitios de corte presentes en la secuencia del gen. Análisis realizado por NEBCutter
· Mutagénesis in vitro del gen que codifica para PBPA.
Se introduce una mutación puntual en la serina del centro activo, situada en la posición 186 de la secuencia de aminoácidos.
Se cambia la serina (AGC) por una prolina (CGC).
Primers utilizados:
Primer 1: 5’ – ATGAACACACCGCTGCGCCG – 3’
Primer 2: 5’ – GGGATCGTAGCGCGGGGT – 3’
Primer 3: 5’ – ACCCCGCGCTACGATCCC – 3’
Primer 4: 5’ – TCAGCCCCCTTGTAGTCCGG – 3’
· Localización celular de PBPA mediante la fusión del gen con la proteína fluorescente verde (GFP).
Primers utilizados para la fusión del gen de interés con GFP:
Primer 1: 5’ – ATGAACACACCGCTGCGCCG – 3’
Primer 2: 5’ – CTTTACTCATGCCCCCTTGTAG – 3’
Primer 3: 5’ – TACAAGGGGGCATGAGTAAAG – 3’
Primer 4: 5’ – TTATTTGTATAGTTCATCCATGC– 3’
RESULTADOS Y DISCUSIÓN En la amplificación del gen que codifica para la proteína PBPA, se amplificó un fragmento de 1172pb. El producto obtenido se corrió en un gel de agarosa al 1,5%, se tiñó con bromuro de etidio y se observo en luz UV. Se obtuvo una única banda de 1,2kb, comprobando así que el gen que codifica para la proteína de interés está presente en el genoma de la cepa utilizada. (Fig. 5)
Fig5. Gel de agarosa mostrando la banda que se ha amplificado
Tanto en la inactivación del gen mediante la inserción del plásmido suicida, como en la mutagénesis puntual cambiando un aminoácido del centro activo de la proteína, se obtuvo el mismo resultado.
Se comprobó que el gen no es esencial para la vida del microorganismo ya que se obtuvieron colonias recombinantes. No obstante, se visualizaron en microscopio para comprobar si producían cambios en el fenotipo de la bacteria. El resultado fue que presentaban un crecimiento menor y forma casi redondeada, perdiendo la forma bacilar. (Fig.6).
Se podían esperar cambios mas pronunciados en el fenotipo ya que la proteína interviene en la síntesis de peptidoglicano y debería ser determinante de la morfología celular. Sin embargo, el fenotipo obtenido no presenta un cambio muy pronunciado debido probablemente al gran número de PBPs y su redundancia funcional (esta frase requiere un explicación y una referencia)
Fig.6 Fenotipo silvestre de Rhodococcus sp.
La fusión de PBPA con la proteína fluorescente verde permitió su localización en la célula. Refleja su situación en la membrana plasmática de Rhodococcus sp.
REFRENCIAS Finnerty, W. R. (1992). The biology and genetics of the genus Rhodococcus. Annual Review of Microbiology, 46, 193-218. doi:10.1146/annurev.mi.46.100192.001205
Joris, B., Ghuysen, J. M., Dive, G., Renard, A., Dideberg, O., Charlier, P., et al. (1988). The active-site-serine penicillin-recognizing enzymes as members of the Streptomyces R61 DD-peptidase family. The Biochemical Journal, 250(2), 313-324.
Larkin, M. J., Kulakov, L. A., & Allen, C. C. (2005). Biodegradation and Rhodococcus--masters of catabolic versatility. Current Opinion in Biotechnology, 16(3), 282-290. doi:10.1016/j.copbio.2005.04.007
Macheboeuf, P., Di Guilmi, A. M., Job, V., Vernet, T., Dideberg, O., & Dessen, A. (2005). Active site restructuring regulates ligand recognition in class A penicillin-binding proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 102(3), 577-582. doi:10.1073/pnas.0407186102
Murray, T., Popham, D. L., & Setlow, P. (1997). Identification and characterization of pbpA encoding Bacillus subtilis penicillin-binding protein 2A. Journal of Bacteriology, 179(9), 3021-3029.
Sekizaki, T., Tanoue, T., Osaki, M., Shimoji, Y., Tsubaki, S., & Takai, S. (1998). Improved electroporation of Rhodococcus equi. The Journal of Veterinary Medical Science / the Japanese Society of Veterinary Science, 60(2), 277-279.
Tabor, S., & Richardson, C. C. (1985). A bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter system for controlled exclusive expression of specific genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 82(4), 1074-1078.
Wada, A., & Watanabe, H. (1998). Penicillin-binding protein 1 of Staphylococcus aureus is essential for growth. Journal of Bacteriology, 180(10), 2759-2765.
Zapun, A., Contreras-Martel, C., & Vernet, T. (2008). Penicillin-binding proteins and beta-lactam resistance. FEMS Microbiology Reviews, 32(2), 361-385. doi:10.1111/j.1574-6976.2007.00095.x
ANEXOS
ANEXO 1
PknA y PknB solapan mucho,
Con el programa informático Artemis se ha analizado una parte de genoma, concretamente una secuencia de 17000 nucleótidos.
Se obtienen los ORF’s válidos y las proteínas para las cuales codifican después de un análisis de cada ORF en el BLAST. De todas las obtenidas se ha elegido una para el presente trabajo (en rojo). Penicillin-binding protein PbpA.
Del National Center for Biotechnology Information (NCBI) se obtiene la secuencia de aminoácidos y de nucleótidos correspondiente a la proteína elegida.
Esas secuencias que ha analizado no son correctas, debía haber usado la que le proporciona Artemis y no la de R. opacus. >gi|226362925|ref|YP_002780705.1| penicillin-binding protein PbpA [Rhodococcus opacus B4]
MNTPLRRVAIAVMVMVVALLANATYVQVIKADNLRADPRNSRVLLDEYSRQRGQISAAGQVLAASVPTDD
RYKYLRTYPPNPAAPSSPLANAPVTGFYSMQYGSTGLERAEDPVLNGSDNRLFGRRFFDLVSGRDPRGGN
VVSTINPVMQQVAYDELTAKGYTGSVVAIEPSTGRILTMVSTPSYDPNSLASHDGTETTQAWEALNADPE
KPLINRAVSQTYPPGSTFKVVVTAAALAAGTTPDTQLTAAPQITLPGTSTTLENYNGSTCGGAPTASLRE
AFARSCNTAFVELGVKTGADAVGDQSSALGIGGQMPGVPFPVADSTIGSIPDDAALGQSSIGQRDVALTP
LQNAMIAATVANGGVRMQPQLVSELQGPDLSNLATTNPVSEGQAMSSQVAATLTDLMIGSENNTSGEGKI
PGVQIASKTGTAEHGTDPRNTPPHAWYIGFAPAQNPTVAIAVIVEDGGDRALAATGGSVAAPIGRAVIAA
GLQGG
La secuencia de nucleótidos que corresponde a PbpA es: ATGAACACACCGCTGCGCCGTGTCGCGATCGCCGTCATGGTGATGGTGGTCGCCCTCCTCGCCAACGCCA
CCTACGTTCAGGTCATCAAGGCGGACAACCTGCGGGCCGATCCGCGGAACTCGCGCGTGCTGCTCGACGA
GTACTCGCGTCAGCGCGGCCAGATCTCGGCGGCCGGGCAGGTGCTCGCGGCCTCCGTTCCGACCGACGAC
CGCTACAAGTACCTGCGGACCTACCCGCCGAACCCGGCGGCGCCGTCGAGCCCGCTGGCCAACGCACCGG
TCACCGGTTTCTACTCGATGCAGTACGGCAGCACCGGACTCGAGCGTGCCGAGGACCCGGTCCTCAACGG
TTCCGACAACCGGCTGTTCGGGCGTCGCTTCTTCGACCTCGTGTCCGGACGCGACCCGCGTGGCGGCAAT
GTGGTGAGCACCATCAACCCGGTGATGCAGCAGGTGGCGTACGACGAGCTGACCGCAAAGGGCTACACCG
GTTCGGTCGTGGCGATCGAGCCGAGCACCGGACGCATCCTCACGATGGTGAGCACCCCGAGCTACGATCC
CAACTCGCTCGCCAGCCACGACGGCACCGAGACCACCCAGGCGTGGGAGGCGCTGAACGCCGATCCGGAG
AAGCCGCTGATCAACCGTGCGGTGTCGCAGACGTACCCGCCCGGTTCCACGTTCAAGGTGGTGGTCACCG
CCGCGGCTCTCGCCGCCGGAACCACCCCCGACACCCAGCTGACCGCGGCCCCGCAGATCACTCTTCCCGG
CACGTCGACGACGCTCGAGAACTACAACGGCTCCACCTGCGGCGGCGCACCCACCGCGTCGCTGCGGGAA
GCGTTCGCGCGGTCCTGCAACACGGCATTCGTCGAACTCGGCGTGAAGACCGGCGCCGACGCCGTCGGCG
ACCAGTCCAGCGCACTCGGCATCGGCGGGCAGATGCCCGGCGTCCCGTTCCCCGTCGCCGACAGCACCAT
CGGGTCGATCCCCGACGACGCCGCACTCGGCCAGAGCAGCATCGGCCAGCGGGACGTGGCGCTCACCCCG
CTGCAGAACGCGATGATCGCGGCTACTGTCGCCAACGGTGGAGTGCGGATGCAGCCACAGCTGGTGTCGG
AACTGCAGGGCCCGGACCTGTCGAACCTCGCGACCACCAACCCGGTGTCCGAGGGCCAGGCGATGTCGTC
GCAGGTGGCGGCTACCCTGACCGATCTGATGATCGGTTCCGAGAACAACACCAGCGGCGAGGGCAAGATC
CCGGGCGTCCAGATCGCGTCCAAGACGGGCACCGCCGAACACGGAACCGACCCACGGAACACCCCGCCCC
ACGCCTGGTACATCGGATTCGCACCCGCCCAGAACCCGACCGTCGCCATCGCGGTCATCGTCGAGGACGG
CGGAGATCGTGCACTGGCCGCAACCGGCGGCTCGGTGGCTGCACCTATCGGCCGTGCCGTCATCGCAGCC
GGACTACAAGGGGGCTGA
ANEXO 2
Peso Molecular: 51006.1 pI Teórico: 4.92
Porcentaje de la composición de aminoácidos presentes en la proteína:
Ala (A) 66 13.3%
Arg (R) 24 4.8%
Asn (N) 24 4.8%
Asp (D) 25 5.1%
Cys (C) 2 0.4%
Gln (Q) 24 4.8%
Glu (E) 17 3.4%
Gly (G) 49 9.9%
His (H) 3 0.6%
Ile (I) 21 4.2%
Leu (L) 36 7.3%
Lys(K) 8 1.6%
Met (M) 11 2.2%
Phe (F) 9 1.8%
Pro (P) 38 7.7%
Ser (S) 38 7.7%
Thr (T) 44 8.9%
Trp (W) 2 0.4%
Tyr (Y) 13 2.6%
Val (V) 41 8.3%
Pyl (O) 0 0.0%
Sec (U) 0 0.0%
(B) 0 0.0%
(Z) 0 0.0%
(X) 0 0.0%
Total number of negatively charged residues (Asp + Glu): 42
Total number of positively charged residues (Arg + Lys): 32
Composición Atómica: Fórmula: C2215H3551N631O723S13
Carbon C 2215 Número total de átomos: 7133
Hydrogen H 3551
Nitrogen N 631
Oxygen O 723
Sulfur S 13
Coeficiente de Extinción:
Extinction coefficients are in units of M-1 cm-1, at 280 nm measured in water.
Ext. coefficient 30495
Abs 0.1% (=1 g/l) 0.598, assuming ALL Cys residues appear as half cystines
Ext. coefficient 30370
Abs 0.1% (=1 g/l) 0.595, assuming NO Cys residues appear as half cystines
La estimación de vida media es: 30 hours (mammalian reticulocytes, in vitro).
>20 hours (yeast, in vivo).
>10 hours (Escherichia coli, in vivo). Aliphatic index: 82.26 Grand average of hydropathicity (GRAVY): -0.102
The instability index (II) is computed to be 33.33
This classifies the protein as stable.
Dominio transmembrana del aminoácido 7 al 29. El resto de la proteína se encuentra en fuera del citoplasma y tan solo del 1 al 6 está dentro.
SignalP 3.0 Server - prediction results
Using neural networks (NN) and hidden Markov models (HMM) trained on Gram-positive bacteria penicillin-binding protein PbpA _Rhodococcus opacus B4_
SignalP-NN result:
SignalP-HMM result:
penicillin-binding
Prediction: Signal peptide
Signal peptide probability: 0.997
Max cleavage site probability: 0.753 between pos. 31 and 32
La proteína tiene péptido señal, es una proteína que se excreta al exterior.
ANEXO 4
El alineamiento se realizó con el programa informático Multalin. Los géneros con los que se comparó nuestra secuencia fueron: Mycobacterium, Actinomyces, Pseudomonas y Escherichia.
Se observaron varias zonas conservadas y se ve claramente la serina del centro activo en la zona conservada situada alrededor de la posición 300.
Al no haber usado la secuencia correcta, el arbol no dice mucho.....
El análisis filogenético se realizó con las mismas secuencias de aminoácidos que el alineamiento y se obtuvo el siguiente árbol filogenético:
Siendo Mycobacterium y Actinomyces los mas próximos a Rhodococcus. Es, por otra parte, como cabria esperar ya que los tres géneros son Actinobacterias, Gram + de alto contenido en G+C.
Raquel Álvarez.
Trabajo bien elaborado, referencias escasas pero bien utilizadas, análisis de Artemis casi correcto, pero ha usado una secuencia de otro microorganismo para hacer el trabajo.
RESUMEN
Las bacterias pertenecientes al género Rhodococcus son Gram positivas con alto contenido en G+C y aerobios. En este trabajo se han analizado 17000 pares de bases pertenecientes al genoma de Rhodococcus sp., eligiendo una proteína perteneciente a la familia de las trasnpeptidasas, la Penicillin-binding protein PbpA, para su análisis. Se realizó un análisis bioinformático para conocer sus características morfológicas y fisicoquímicas, así como también se llevo a cabo una inactivación del gen y una mutagénesis para comprobar como la actividad de la proteína influía en el fenotipo de Rhodococcus sp. Posteriormente se realizó una purificación y una fusión con la proteína fluorescente verde para su localización en la membrana plasmática de la célula.
INTRODUCCIÓN
Las bacterias pertenecientes al género Rhodococcus son Gram positivas con alto contenido en G+C y aerobios. Presentan una amplia diversidad metabólica, sobre todo a los compuestos hidrófobos, como los hidrocarburos clorados, compuestos fenólicos, esteroides, lignina, carbón y petróleo (Finnerty, 1992). Es un grupo muy diverso de bacterias que posee la capacidad de degradar una gran cantidad de compuestos orgánicos. Los usos de Rhodococcus incluyen la producción esteroides bioactivos, la biodesulfurización del combustible fósil, y la producción de la acrilamida y del ácido de acrílico. (Larkin, Kulakov, & Allen, 2005). Algunos miembros del género Rhodococcus son conocidos agentes patógenos para los seres humanos, animales y plantas, aunque la mayor parte de las especies que pertenecen a este género no son patógenas.
Clasificación:
Reino: Bacteria
Filo: Actinobacteria
Orden: Actinomycetales
Suborden: Corynebacterineae
Familia: Nocardiaceae
Género: Rhodococcus
Penicillin-binding protein PbpA
El trabajo está centrado en una proteína concreta, la Penicillin-binding protein PbpA (o proteína de unión a la penicilina A). Fig.1
Existen numerosas PBPs diferentes y son habitualmente específicas de cada especie. Son proteínas situadas en la membrana plasmática de la bacteria e intervienen en la formación de la pared celular. La PbpA pertenece al grupo de PBP’s de alto peso molecular, tiene actividad transpeptidasa y actúan en la última fase de la formación del peptidoglycano (Murray, Popham, & Setlow, 1997). Forma un enlace peptídico entre dos D-ala de dos polímeros distintos de peptidoglycano formados en fases anteriores. Las PBP’s intervienen en la formación de la pared y por lo tanto en el crecimiento de la bacteria y en la conformación de la estructura (Wada & Watanabe, 1998).
El nombre de proteína de unión a penicilina (PBP) es debido a que estas enzimas son el sitio de acción de las penicilinas (y otros antibióticos ß-lactámicos) y las bloquean debido a que el anillo β- lactámico tiene una estructura espacial similar a la del residuo acil-D-alanin-D-alanina de las cadenas del peptidoglicano, que es el sustrato natural de las PBP (Zapun, Contreras-Martel, & Vernet, 2008).
Análisis Bioinformático de PbpA
Penicillin-binding protein PbpA se encuentra entre los nucleótidos 3810204 al 3811691 de la cadena complementaria del genoma de Rhodococcus sp., tiene una longitud total de 1.49kb que codifican para un péptido de 495 aminoácidos (ver Anexo 1).
Las características fisico-químicas de la proteína fueron analizadas bioinformáticamente mediante ProtParam. (ver Anexo 2)
Como anteriormente se ha comentado la PBPA está localizada en la membrana plasmática, no obstante se realizo el análisis bioinformático correspondiente prediciendo la situación de la proteína en la célula (PSORTb) y localizando hélices transmembrana en la proteína (TMHMM). También se buscó la presencia de péptido líder mediante SignalP 3.0 Server .
Los resultados indican que se trata de una proteína localizada en la membrana plasmática, con un dominio transmembrana y el resto de la proteína es extracelular. Por último se verificó la presencia de péptido señal. (ver Anexo 3).
Penicillin binding protein PBPA presenta un dominio que pertenece a la superfamilia de trasnpeptidasas. Cataliza la reacción que da lugar al enlace peptídico entre dos D-ala (transpeptidación) en la formación del peptidoglycano de la pared celular (Macheboeuf et al., 2005)
Se realizó un análisis bioinformático para saber que familia pertenece la proteína mediante el programa Pfam reafirmando que se trata de un transpeptidasa.
Según los datos obtenidos se trata de un dominio transpeptidasa que comienza en el aminoácido 164 y termina en el 489.
Mediante la base de datos de proteínas del NBCI se busco la secuencia de aminoácidos de distintas especies de bacterias de la proteína PBPA con el fin de hacer un alineamiento y ver las zonas conservadas. Posteriormente se dibujó un árbol filogenético.
El sitio activo de la trasnspeptidasa es una serina que está conservada en todos los miembros de esta familia (Joris et al., 1988). (ver Anexo 4)
MATERIALES Y MÉTODOS
· Cepas bacterianas y condiciones de cultivo.
En el presente trabajo se utilizaron las siguientes cepas:
Rhodococcus sp.
E.coli K12
E.coli BL21(DE3).
Las cepas de E.coli son cultivadas en medio Luria-Bertani (LB) (1% triptófano, 0,5% de extracto de levadura y 0,5% de NaCl) a 37ºC.
Para la sobreexpresión de genes clonados los cultivos se crecieron en medio rico en triptófano (3,2%), 2% de extracto de levaduray 1% de NaCl.
Rhodococcus sp. es cultivada en medio Brain Heart Infusion (BHI) a 30ºC.
Cuando sea necesario, se añadiran los siguientes suplementos en el medio:
Ampicilina, kanamicina, e IPTG.
· Amplificación del gen de interés por PCR.
Mediante PCR se amplificó un fragmento de 1172 pb del gen que codifica para la proteína PBPA. Los primers utilizados fueron diseñados por el programa informático Primer3.
Está Ud. segura que estos primers amplifican el gen??? Para qué realiza esta amplificación???
Primer Directo: 5’- GCCACCTACGTTCAGGTCAT - 3’
Primer Reverso: 5’- TTGTTCTCGGAACCGATCAT - 3’
La reacción de PCR se llevó a cabo en un termociclador programado para realizar una desnaturalización inicial del ADN a 95ºC durante 4 min, seguida de 35 ciclos que comprenden las siguientes etapas: 40 segundos a 93ºC, 40 segundos a 55ºC y 55 segundos a 72ºC. La última extensión se prolongó durante 5 min.
El producto de amplificación se visualizó en gel de agarosa al 1,5% teñido con bromuro de Etidio
· Comprobación si el gen es esencial o no para el microorganismo.
Se realiza una interrupción génica mediante plásmidos suicidas. Para ello es necesario amplificar un fragmento interno del gen y clonarlo en un plásmido que no replicativo en Rhodococcus.
La obtención de plasmidos se realizo de igual forma que en el apartado anterior, mediante el programa Primer3.
Primer Directo: 5’- AACTACAACGGCTCCACCTG – 3’
Primer Reverso: 5’- TTGTTCTCGGAACCGATCAT – 3’
Para poder clonar el fragmento en un plásmido se les añade un sitio de corte en el extremo 5’. En el primer 1 un sitio HindIII y en el primer 2 un sitio BamHI, además de 3 nucleótidos para que el corte sea efectivo.
Primer Directo: 5’- CCCA/AGCTTAACTACAACGGCTCCACCTG – 3’
Primer Reverso: 5’- CGCG/GATCCTTGTTCTCGGAACCGATCAT – 3’
Con estos primers se amplifica un fragmento interno de 449 pb que va a ser clonado en un plásmido pUC19 (Fig.2) contiene el origen de replicación de E. coli, no replicando en Rhodococcus, y el gen de resistencia a ampicilina. También incluye el gen lacZ, donde se encuentra el sitio de clonación múltiple o polilinker.
El plásmido es insertado en Rhodococcus mediante electroporación (Sekizaki et al., 1998). Si lleva el inserto del gen se integrará por recombinación simple en el genoma de Rhodococcus, inactivando el gen y produciendo un RNAm no funcional.
· Purificación de la proteína.
La purificación de la proteína se realiza mediante la amplificación del gen que codifica para PBPA con colas de histidina.
Los primers utilizados para la amplificación del gen son:
Primer 1: 5’- GGAATTCCA/TATGAACACACCGCTGCGCCG – 3’ (NdeI)
Primer 2: 5’- CCCA/AGCTTGCCCCCTTGTAGTCCGGCTG – 3’ (HindIII)
Los productos amplificados se clonan en el plásmido pET-28a(+) (Fig.3). (Novagen)
pET-28a (+) tiene 5369 pb y contiene el gen resistencia a kanamicina, posee una secuencia aminoterminal que contiene His·Tag/trombina/T7 Tag y una configuración adicional en el C-terminal el cual lleva una cola de histidinas para su purificación.
Los genes clonados en el plásmido pET se transcriben bajo el control del promotor del fago T7, cuando se activa la T7 RNA polimerasa en la célula huésped. La expresión se induce con IPTG, el cual remueve al represor del operador para que se lleve a cabo la transcripción y se promueva la expresión de la proteína de interés (Tabor & Richardson, 1985).
El plásmido con el gen de interés se introduce mediante transformación en E.coli BL21(DE3) cuyo genoma contiene el gen que codifica para la T7 RNA polimerasa y carece de proteasas. Se seleccionan las cepas trasnformadas añadiendo al medio kanamicina.
La proteína fusionada a colas de histidina se purifica mediante cromatografía de afinidad utilizando resinas que llevan níquel unido a bolas de agarosa. Posteriormente para eliminar las colas de histidina utilizamos la peptidasa trombina, que corta en una serie de aminoácidos que se encuentran entre las histidinas y nuestra proteína.
Previamente se comprobó mediante PeptideCutter que la proteína a purificar no es degradada por la trombina.
· Comprobación de sitios de corte por enzimas de restricción.
Se comprobó mediante el programa NEBCutter que ninguno de los sitios de corte utilizados para la clonación en plásmidos estuviera presentes en la secuencia del gen. (Fig. 4)
· Mutagénesis in vitro del gen que codifica para PBPA.
Se introduce una mutación puntual en la serina del centro activo, situada en la posición 186 de la secuencia de aminoácidos.
Se cambia la serina (AGC) por una prolina (CGC).
Primers utilizados:
Primer 1: 5’ – ATGAACACACCGCTGCGCCG – 3’
Primer 2: 5’ – GGGATCGTAGCGCGGGGT – 3’
Primer 3: 5’ – ACCCCGCGCTACGATCCC – 3’
Primer 4: 5’ – TCAGCCCCCTTGTAGTCCGG – 3’
· Localización celular de PBPA mediante la fusión del gen con la proteína fluorescente verde (GFP).
Primers utilizados para la fusión del gen de interés con GFP:
Primer 1: 5’ – ATGAACACACCGCTGCGCCG – 3’
Primer 2: 5’ – CTTTACTCATGCCCCCTTGTAG – 3’
Primer 3: 5’ – TACAAGGGGGCATGAGTAAAG – 3’
Primer 4: 5’ – TTATTTGTATAGTTCATCCATGC – 3’
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tanto en la inactivación del gen mediante la inserción del plásmido suicida, como en la mutagénesis puntual cambiando un aminoácido del centro activo de la proteína, se obtuvo el mismo resultado.
Se comprobó que el gen no es esencial para la vida del microorganismo ya que se obtuvieron colonias recombinantes. No obstante, se visualizaron en microscopio para comprobar si producían cambios en el fenotipo de la bacteria. El resultado fue que presentaban un crecimiento menor y forma casi redondeada, perdiendo la forma bacilar. (Fig.6).
Se podían esperar cambios mas pronunciados en el fenotipo ya que la proteína interviene en la síntesis de peptidoglicano y debería ser determinante de la morfología celular. Sin embargo, el fenotipo obtenido no presenta un cambio muy pronunciado debido probablemente al gran número de PBPs y su redundancia funcional (esta frase requiere un explicación y una referencia)
La fusión de PBPA con la proteína fluorescente verde permitió su localización en la célula. Refleja su situación en la membrana plasmática de Rhodococcus sp.
REFRENCIAS
Finnerty, W. R. (1992). The biology and genetics of the genus Rhodococcus. Annual Review of Microbiology, 46, 193-218. doi:10.1146/annurev.mi.46.100192.001205
Joris, B., Ghuysen, J. M., Dive, G., Renard, A., Dideberg, O., Charlier, P., et al. (1988). The active-site-serine penicillin-recognizing enzymes as members of the Streptomyces R61 DD-peptidase family. The Biochemical Journal, 250(2), 313-324.
Larkin, M. J., Kulakov, L. A., & Allen, C. C. (2005). Biodegradation and Rhodococcus--masters of catabolic versatility. Current Opinion in Biotechnology, 16(3), 282-290. doi:10.1016/j.copbio.2005.04.007
Macheboeuf, P., Di Guilmi, A. M., Job, V., Vernet, T., Dideberg, O., & Dessen, A. (2005). Active site restructuring regulates ligand recognition in class A penicillin-binding proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 102(3), 577-582. doi:10.1073/pnas.0407186102
Murray, T., Popham, D. L., & Setlow, P. (1997). Identification and characterization of pbpA encoding Bacillus subtilis penicillin-binding protein 2A. Journal of Bacteriology, 179(9), 3021-3029.
Sekizaki, T., Tanoue, T., Osaki, M., Shimoji, Y., Tsubaki, S., & Takai, S. (1998). Improved electroporation of Rhodococcus equi. The Journal of Veterinary Medical Science / the Japanese Society of Veterinary Science, 60(2), 277-279.
Tabor, S., & Richardson, C. C. (1985). A bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter system for controlled exclusive expression of specific genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 82(4), 1074-1078.
Wada, A., & Watanabe, H. (1998). Penicillin-binding protein 1 of Staphylococcus aureus is essential for growth. Journal of Bacteriology, 180(10), 2759-2765.
Zapun, A., Contreras-Martel, C., & Vernet, T. (2008). Penicillin-binding proteins and beta-lactam resistance. FEMS Microbiology Reviews, 32(2), 361-385. doi:10.1111/j.1574-6976.2007.00095.x
ANEXOSANEXO 1
Con el programa informático Artemis se ha analizado una parte de genoma, concretamente una secuencia de 17000 nucleótidos.
Se obtienen los ORF’s válidos y las proteínas para las cuales codifican después de un análisis de cada ORF en el BLAST. De todas las obtenidas se ha elegido una para el presente trabajo (en rojo). Penicillin-binding protein PbpA.
Del National Center for Biotechnology Information (NCBI) se obtiene la secuencia de aminoácidos y de nucleótidos correspondiente a la proteína elegida.
Esas secuencias que ha analizado no son correctas, debía haber usado la que le proporciona Artemis y no la de R. opacus.
>gi|226362925|ref|YP_002780705.1| penicillin-binding protein PbpA [Rhodococcus opacus B4]
MNTPLRRVAIAVMVMVVALLANATYVQVIKADNLRADPRNSRVLLDEYSRQRGQISAAGQVLAASVPTDD
RYKYLRTYPPNPAAPSSPLANAPVTGFYSMQYGSTGLERAEDPVLNGSDNRLFGRRFFDLVSGRDPRGGN
VVSTINPVMQQVAYDELTAKGYTGSVVAIEPSTGRILTMVSTPSYDPNSLASHDGTETTQAWEALNADPE
KPLINRAVSQTYPPGSTFKVVVTAAALAAGTTPDTQLTAAPQITLPGTSTTLENYNGSTCGGAPTASLRE
AFARSCNTAFVELGVKTGADAVGDQSSALGIGGQMPGVPFPVADSTIGSIPDDAALGQSSIGQRDVALTP
LQNAMIAATVANGGVRMQPQLVSELQGPDLSNLATTNPVSEGQAMSSQVAATLTDLMIGSENNTSGEGKI
PGVQIASKTGTAEHGTDPRNTPPHAWYIGFAPAQNPTVAIAVIVEDGGDRALAATGGSVAAPIGRAVIAA
GLQGG
La secuencia de nucleótidos que corresponde a PbpA es:
ATGAACACACCGCTGCGCCGTGTCGCGATCGCCGTCATGGTGATGGTGGTCGCCCTCCTCGCCAACGCCA
CCTACGTTCAGGTCATCAAGGCGGACAACCTGCGGGCCGATCCGCGGAACTCGCGCGTGCTGCTCGACGA
GTACTCGCGTCAGCGCGGCCAGATCTCGGCGGCCGGGCAGGTGCTCGCGGCCTCCGTTCCGACCGACGAC
CGCTACAAGTACCTGCGGACCTACCCGCCGAACCCGGCGGCGCCGTCGAGCCCGCTGGCCAACGCACCGG
TCACCGGTTTCTACTCGATGCAGTACGGCAGCACCGGACTCGAGCGTGCCGAGGACCCGGTCCTCAACGG
TTCCGACAACCGGCTGTTCGGGCGTCGCTTCTTCGACCTCGTGTCCGGACGCGACCCGCGTGGCGGCAAT
GTGGTGAGCACCATCAACCCGGTGATGCAGCAGGTGGCGTACGACGAGCTGACCGCAAAGGGCTACACCG
GTTCGGTCGTGGCGATCGAGCCGAGCACCGGACGCATCCTCACGATGGTGAGCACCCCGAGCTACGATCC
CAACTCGCTCGCCAGCCACGACGGCACCGAGACCACCCAGGCGTGGGAGGCGCTGAACGCCGATCCGGAG
AAGCCGCTGATCAACCGTGCGGTGTCGCAGACGTACCCGCCCGGTTCCACGTTCAAGGTGGTGGTCACCG
CCGCGGCTCTCGCCGCCGGAACCACCCCCGACACCCAGCTGACCGCGGCCCCGCAGATCACTCTTCCCGG
CACGTCGACGACGCTCGAGAACTACAACGGCTCCACCTGCGGCGGCGCACCCACCGCGTCGCTGCGGGAA
GCGTTCGCGCGGTCCTGCAACACGGCATTCGTCGAACTCGGCGTGAAGACCGGCGCCGACGCCGTCGGCG
ACCAGTCCAGCGCACTCGGCATCGGCGGGCAGATGCCCGGCGTCCCGTTCCCCGTCGCCGACAGCACCAT
CGGGTCGATCCCCGACGACGCCGCACTCGGCCAGAGCAGCATCGGCCAGCGGGACGTGGCGCTCACCCCG
CTGCAGAACGCGATGATCGCGGCTACTGTCGCCAACGGTGGAGTGCGGATGCAGCCACAGCTGGTGTCGG
AACTGCAGGGCCCGGACCTGTCGAACCTCGCGACCACCAACCCGGTGTCCGAGGGCCAGGCGATGTCGTC
GCAGGTGGCGGCTACCCTGACCGATCTGATGATCGGTTCCGAGAACAACACCAGCGGCGAGGGCAAGATC
CCGGGCGTCCAGATCGCGTCCAAGACGGGCACCGCCGAACACGGAACCGACCCACGGAACACCCCGCCCC
ACGCCTGGTACATCGGATTCGCACCCGCCCAGAACCCGACCGTCGCCATCGCGGTCATCGTCGAGGACGG
CGGAGATCGTGCACTGGCCGCAACCGGCGGCTCGGTGGCTGCACCTATCGGCCGTGCCGTCATCGCAGCC
GGACTACAAGGGGGCTGA
ANEXO 2
Peso Molecular: 51006.1
pI Teórico: 4.92
Porcentaje de la composición de aminoácidos presentes en la proteína:
Ala (A) 66 13.3%
Arg (R) 24 4.8%
Asn (N) 24 4.8%
Asp (D) 25 5.1%
Cys (C) 2 0.4%
Gln (Q) 24 4.8%
Glu (E) 17 3.4%
Gly (G) 49 9.9%
His (H) 3 0.6%
Ile (I) 21 4.2%
Leu (L) 36 7.3%
Lys(K) 8 1.6%
Met (M) 11 2.2%
Phe (F) 9 1.8%
Pro (P) 38 7.7%
Ser (S) 38 7.7%
Thr (T) 44 8.9%
Trp (W) 2 0.4%
Tyr (Y) 13 2.6%
Val (V) 41 8.3%
Pyl (O) 0 0.0%
Sec (U) 0 0.0%
(B) 0 0.0%
(Z) 0 0.0%
(X) 0 0.0%
Total number of negatively charged residues (Asp + Glu): 42
Total number of positively charged residues (Arg + Lys): 32
Composición Atómica: Fórmula: C2215H3551N631O723S13
Carbon C 2215 Número total de átomos: 7133
Hydrogen H 3551
Nitrogen N 631
Oxygen O 723
Sulfur S 13
Coeficiente de Extinción:
Extinction coefficients are in units of M-1 cm-1, at 280 nm measured in water.
Ext. coefficient 30495
Abs 0.1% (=1 g/l) 0.598, assuming ALL Cys residues appear as half cystines
Ext. coefficient 30370
Abs 0.1% (=1 g/l) 0.595, assuming NO Cys residues appear as half cystines
La estimación de vida media es: 30 hours (mammalian reticulocytes, in vitro).
>20 hours (yeast, in vivo).
>10 hours (Escherichia coli, in vivo).
Aliphatic index: 82.26
Grand average of hydropathicity (GRAVY): -0.102
The instability index (II) is computed to be 33.33
This classifies the protein as stable.
ANEXO 3
PSORTb Resultados
SeqID: penicillin-binding protein PbpA [Rhodococcus opacus B4]
Analysis Report:
HMMTOP+ Unknown [1 internal helix found]
Motif+ Unknown [No motifs found]
Profile+ Unknown [No matches to profiles found]
SCL-BLAST+ CytoplasmicMembrane [matched 20141780: Cytoplasmic membrane integral membrane protein]
SCL-BLASTe+ Unknown [No matches against database]
Signal+ Non-Cytoplasmic [Signal peptide detected]
Localization Scores:
Cytoplasmic 0.00
CytoplasmicMembrane 9.83
Cellwall 0.01
Extracellular 0.16
Final Prediction:
CytoplasmicMembrane 9.83
TMHMM resultados
- penicillin-binding Length: 495
- penicillin-binding Number of predicted TMHs: 1
- penicillin-binding Exp number of AAs in TMHs: 22.47035
- penicillin-binding Exp number, first 60 AAs: 22.40518
- penicillin-binding Total prob of N-in: 0.99068
- penicillin-binding POSSIBLE N-term signal sequence
penicillin-binding TMHMM2.0 inside 1 6penicillin-binding TMHMM2.0 TMhelix 7 29
penicillin-binding TMHMM2.0 outside 30 495
Dominio transmembrana del aminoácido 7 al 29. El resto de la proteína se encuentra en fuera del citoplasma y tan solo del 1 al 6 está dentro.
SignalP 3.0 Server - prediction results
Using neural networks (NN) and hidden Markov models (HMM) trained on Gram-positive bacteria
penicillin-binding protein PbpA _Rhodococcus opacus B4_
SignalP-NN result:
SignalP-HMM result:
penicillin-binding
Prediction: Signal peptide
Signal peptide probability: 0.997
Max cleavage site probability: 0.753 between pos. 31 and 32
La proteína tiene péptido señal, es una proteína que se excreta al exterior.
ANEXO 4
El alineamiento se realizó con el programa informático Multalin. Los géneros con los que se comparó nuestra secuencia fueron: Mycobacterium, Actinomyces, Pseudomonas y Escherichia.
Se observaron varias zonas conservadas y se ve claramente la serina del centro activo en la zona conservada situada alrededor de la posición 300.
Al no haber usado la secuencia correcta, el arbol no dice mucho.....
El análisis filogenético se realizó con las mismas secuencias de aminoácidos que el alineamiento y se obtuvo el siguiente árbol filogenético:
Siendo Mycobacterium y Actinomyces los mas próximos a Rhodococcus. Es, por otra parte, como cabria esperar ya que los tres géneros son Actinobacterias, Gram + de alto contenido en G+C.